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背景介绍

富血小板血浆(PRP)是自体全血经由离心浓缩制得的血液制品，其主要成分为浓缩后的血小板[1]。血小板内含有多种细胞器，包括a-颗粒、致密颗粒和溶酶体等，其中a-颗粒中包含大量生长因子。PRP受刺激后会脱颗粒释放大量的生长因子，如P-选择素、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板源生长因子(PDGF)等，这些因子通过相互介导，可形成广泛且多层次的信号分子调控网络，促进成纤维细胞、神经胶质细胞、上皮及内皮细胞的增殖，加速伤口愈合和组织修复。

目前PRP多用于退行性疾病、难愈性创面修复、急慢性损伤、烧伤和角膜损伤等多种临床疾病的治疗，已被广泛应用于运动医学科、康复医学科、心脏外科、妇科、整形外科和眼科等多个学科领域。PRP治疗的一个疗程多为1～3周，但其常规保存期只有5 d，超过保存期以后的PRP由于理化性质等方面的改变会导致PRP失活，致血液浪费。因此，如何长期保存PRP是目前临床的一大难题。本研究通过将PRP在一80℃深低温短期保存后，比较冷冻前后其pH值的变化，以及其内P一选择素、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板源生长因子(PDGF)等重要生长因子浓度的变化，为PRP低温储存提供理论依据。现将结果报告如下。

资料与方法

结果

1. 各组PRP的pH值以及PDGF、P选择素、VEGF水平比较

A～E组PRP的pH值比较差异无显著意义(P>0.05)，各组中P一选择素、PDGF和VEGF的水平比较差异无显著性(P>0.05)。见表1。

2.PRP中的生长因子对于HUVEC血管形成的影响

A组和E组中HUVEC的血管形成数量分别为(49.67±3.79)、(50.00±1.00)个，两组比较差异无显著性(P>o．05)。见图1。

讨论

PRP中血小板的浓度远高于生理基线，在受到刺激后血小板会释放大量与创伤愈合相关的生长因子和黏附蛋白，从而启动细胞和组织的修复并加快其进程。PRP释放的大量生长因子能通过自分泌、旁分泌和内分泌等机制启动损伤修复级联反应，通过刺激细胞的迁移和增殖、血管生成和基质的合成等途径，启动和促进伤口的愈合和修复。

近些年来PRP已被开发应用于临床中的多个学科。PRP治疗每疗程多不超过3次，时间间隔多为1～3周。据此，本研究探索-80℃冻存5、10、15、20 d后PRP的pH值及其内各种细胞因子的变化，研究结果可为临床应用提供依据。

离体后的血小板失去细胞内环境的保护作用会变得极其脆弱，容易受剧烈震荡、温度和pH值变化等影响而引起血小板的聚集和碎裂，从而影响其生物学功能。常规在临床上PRP多在(22±2)℃的恒温振荡箱中保存，并且保存时间不超过5d。依靠这种常温振荡保存方法，PRP保存时问短、易污染和功效易降低或失活等缺点给临床治疗带来诸多不便，还需要对患者进行频繁血液样本采集，为患者带来巨大精神和经济压力。因此，在不损害PRP功能的前提下对其进行冻存也已成为关注热点之一。随着深低温冰箱的推广，本研究分析PRP储存在-80℃冰箱后其pH值及各种因子水平的变化，以探索延长PRP临床应用时间的方法。

PRP发挥生理功能的最适pH值约为6.5～7.2，在常温保存过程中，PRP仍会进行有氧代谢和糖酵解等新陈代谢，糖酵解产生的乳酸和氢离子积累到一定浓度时会使得PRP的pH值迅速下降，当pH值下降至6.0～6.1时，血小板形态由圆盘状变为圆球状，并且此不可逆的形态变化伴随血小板数量下降和释放的各类生长因子生物学功能的完全丧失。低温能够减慢其新陈代谢进程，降低乳酸的生成和积累，维持血浆缓冲作用。本研究结果显示，新鲜PRP及-80℃冻存5、10、15、20 d的PRP比较，各组的pH值不存在显著差异，说明在80℃冻存条件下能够延缓PRP糖酵解作用引起的乳酸堆积，延缓pH下降的速度，延长保存时间。

血小板释放的各种生长因子中，PDGF是一种刺激组织细胞生长的肽类调节分子，生理状态下存在于血小板a颗粒中有研究表明，PDGF在早期发育阶段能通过结合P13K／Akt、JAK／STAT和Src等多条跨膜酪氨酸通路促进细胞有丝分裂和趋化，从而刺激伤口处成纤维细胞、平滑肌细胞和其他细胞的分裂增殖。在后期成熟期，PDGF则可促进组织重塑以及特殊细胞的分化。本研究结果湿示，新鲜PRP及-80℃冻存5、10、15、20 d的PRP比较，各组中PDGF含量无显著差异，提示冻存的PRP在PDGF水平释放上可以满足临床应用需求。

VEGF是一类重要的具有促血管生成活性的生长因子，对内皮细胞有促进有丝分裂和抗凋广作用，能够增加血管通透性，促进细胞迁移阳。既往研究显示，VEGF可以通过PI．C7 ERK和PIC7 PKC

通路来调节细胞增殖，从而促进创面愈合Ⅲ。同时，VEGF是促进血管和淋巴管形成的重要因子，新生的血管和淋巴管可为创面组织的新生和修复供应充足的养分，促进伤口的愈合。本研究中，新鲜PRP及-80℃冻存5、10、15、20 d的PRP比较，各组中VEGF含量比较无显著差异；同时新鲜PRP和-80℃冻存20 d的PRP对HUVEC血管形成能力的影响也无显著差异。提示冻存5、10、15、20 d

并不会对PRP的VEGF浓度造成影响，在促进新生血管的生成中的作用与新鲜PRP相近。

另外，血小板中的P-选择素作为黏附分子家族一员，能够介导粒细胞和单核细胞在内皮细胞表面的滚动以及血小板之间的黏附作用，不仅能够参与细胞问和细胞细胞外基质的相互作用，调节参与信号转导途径和炎症的发生发展，而且是在血栓形成和凝血过程中发挥有重要作用。P选择素能够易位到活化后的血小板表面，支持血小板-血小板之间的相互作用，促进血栓形成和凝血。不仅如此，P-选择素还能够促进损伤部位对白细胞的募集，此行为能够加速炎症的早期进程。本研究中，PRP在-80℃冻存5、10、15、20 d后，与新鲜PRP释放的P选择素比较，并无显著差异。可见，P选择素在冰冻20 d后仍能发挥其正常生物学功能。

综上所述，-80℃冻存5、10、15、20 d均不影响PRP中PDGF、P一选择素和VEGF等重要生长因子的含量及其生物学功能，同时能够显著延缓其pH值下降的速度，较长时问维持PRP功能。该研究结果为临床长时间保存PRP提供了一定的理论依据。